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The role of the Hyriopsis cumingii shell silk-like matrix protein silkmaxin in the shell and pearl biomineralization

  • Shell matrix proteins control the nuleation、size and crystal phase of calcium carbonate during the biomineralization of pearl, and they are related to pearl quality. In order to study more about the molecular mechanism of nacre formation, we cloned a novel shell matrix protein silkmaxin (accession No. MK188932) from freshwater mussel Hyriopsis cumingii. With the gene expression detected by RT-PCR and in situ hybridization, silkmaxin specially expressed in the pallial epithelial cells of mantle outer fold, which indicated that silkmaxin is a nacreous layer matrix protein. The amino acid sequence of silkmaxin featured high proportion of Gly (33.0%) and Ser (10.4%) residues, and the second structure is mainly composed of β-folds. The high structure prediction indicated that silkmaxin is a silk-like protein. In addition, the expression of silkmaxin was detected in the early stage of pearl formation by real-time quantitative PCR. The results indicated that silkmaxin play important roles in the transition of the calcium carbonate disordered deposition to ordered deposition in the early stage of pearl formation. The study of shell by silkmaxin RNAi treatment indicates that silkmaxin is essential for the correct growth of aragonite tablets, including the size and shape of the newly formed calcium carbonate crystals.
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通讯作者: 陈斌, bchen63@163.com
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    沈阳化工大学材料科学与工程学院 沈阳 110142

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The role of the Hyriopsis cumingii shell silk-like matrix protein silkmaxin in the shell and pearl biomineralization

    Corresponding author: Xiaojun LIU, txliuxj@vip.163.com
    Corresponding author: Jiale LI, jlli@shou.edu.cn
  • 1. Key Laboratory of Freshwater Aquatic Genetic Resources, Shanghai Ocean University, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Shanghai    201306, China
  • 2. National Demonstration Center for Experimental Fisheries Science Education, Shanghai Ocean University, Shanghai    201306, China
  • 3. Key Laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources, Ministry of Education, Shanghai Ocean University, Shanghai    201306, China

Abstract: Shell matrix proteins control the nuleation、size and crystal phase of calcium carbonate during the biomineralization of pearl, and they are related to pearl quality. In order to study more about the molecular mechanism of nacre formation, we cloned a novel shell matrix protein silkmaxin (accession No. MK188932) from freshwater mussel Hyriopsis cumingii. With the gene expression detected by RT-PCR and in situ hybridization, silkmaxin specially expressed in the pallial epithelial cells of mantle outer fold, which indicated that silkmaxin is a nacreous layer matrix protein. The amino acid sequence of silkmaxin featured high proportion of Gly (33.0%) and Ser (10.4%) residues, and the second structure is mainly composed of β-folds. The high structure prediction indicated that silkmaxin is a silk-like protein. In addition, the expression of silkmaxin was detected in the early stage of pearl formation by real-time quantitative PCR. The results indicated that silkmaxin play important roles in the transition of the calcium carbonate disordered deposition to ordered deposition in the early stage of pearl formation. The study of shell by silkmaxin RNAi treatment indicates that silkmaxin is essential for the correct growth of aragonite tablets, including the size and shape of the newly formed calcium carbonate crystals.

  • 生物矿化在自然界中普遍存在,包括脊椎动物的骨骼、硬骨鱼的牙齿以及一些动物的结石和鱼类的耳石等诸多生物体内外的特殊硬组织都属于生物矿化的产物。这些硬组织在生物体的生命活动中所起的的作用非常广泛,如脊椎动物骨骼可以对其结构起到支撑作用,在软体动物中贝壳归属于外骨骼部分,可以保护内部软体区域免受外界对其造成的伤害[1]。珍珠同样也是一种生物矿化的产物,其结构、成份与贝壳相近,在自然界中的形成类似于结石,二者形成机理均是由砂砾或者虫卵等异物侵入以后逐渐形成的[2-3]。其结构成分包含95%的碳酸钙和少于5%的有机基质,有机基质主要是由基质蛋白(matrix proteins)组成,还包括少量的几丁质、糖和脂肪等[4]。这些基质蛋白同样也参与了对矿化位点的有机框架结构的构建,以及碳酸钙晶体的成核、定向生长和晶型控制等几个过程,这些过程在贝壳和珍珠的矿化过程中起着非常关键的调控作用[5]。在淡水珍珠的人工生产过程中,通过手术植入小片诱导形成珍珠囊,珍珠囊细胞再进一步分泌珍珠质形成珍珠[2]。刘晓军等[6]通过氮碳的比值来测珠核表面的蛋白质含量,发现在分泌物最重要的有机成分就是蛋白,基质蛋白调控了珍珠囊分泌物由无序沉积向有序沉积转变的过程,对珠核表面珍珠层的最终形成起到关键性作用。基质蛋白基因是珍珠形成过程中非常重要的一类功能基因,对其进行的分析研究对我国珍珠养殖生物技术的发展具有非常重要的意义。

    三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)是我国最重要的淡水产珠蚌,其中生产的淡水珍珠占我国珍珠总产量的90%以上。目前已经从三角帆蚌中分离和鉴定了若干个基质蛋白基因,其中有Nacrein[7]Hcperlucin[8]HcCA[9]Silkmapin[10]Hic22[11]Hic31[12]Hic52[13]Hic74[14]HcTyr[15]Hic24[16]Hc-Upsalin[17],这些基质蛋白在贝壳的形成过程中都起到了非常重要的作用。如Nacrein和HcCA作为碳酸酐酶,可将二氧化碳转化为碳酸氢根离子;为生物矿化过程提供了反应的原料;Silkmapin、Hic74、Hic31和Hic52都是贝壳微观结构框架蛋白;Silkmapin和Hic74都属于典型的类丝状蛋白;而Hic31和Hic52都是富含甘氨酸的基质蛋白,且部分氨基酸序列具有与胶原蛋白类似的结构特征,这些蛋白质在体外可以构建有机框架,从而为矿化的进一步进行提供了反应空间和成核位点;HcTyr作为酪氨酸酶,在一般生物体内与色素的形成相关,而在三角帆蚌中则与贝壳珍珠层的颜色色形成机理有关;Hic24是珍珠层成核所必需的基质蛋白,当其在外套膜中的表达被有效抑制时,贝壳表面新沉积的碳酸钙晶体就不能在准确的位置发生成核过程,甚至有的导致无序沉积的现象出现[8-18]

    本实验从三角帆蚌cDNA文库中克隆和鉴定了一个新的基质蛋白基因silkmaxin,并且通过了序列分析、半定量PCR、原位杂交、珍珠囊早期发育阶段表达量检测和RNA干扰(RNAi)等一系列实验的深入研究以探究其在三角帆蚌生物矿化过程中的功能。

    • 实验材料为浙江省武义水产养殖有限公司养殖的1龄左右的三角帆蚌20只,于2017年3月25日运回实验室后放在河道中暂养5 d为避免压力反应,随机从中选取10只健康个体,其体长约(50.5~53.7) mm,体高为(24.75~27.83) mm,体宽为(10.08~11.38) mm,体质量为(9.34~12.69) g。提前配置好75%的酒精,将取组织需要的样钳、剪刀、研钵和研杵,用无酶水进行清洗,用锡箔纸包好放入180 °C烘箱消毒6 h。分别取其边缘膜、中央膜、缘膜部、鳃、闭壳肌、斧足、血液、性腺、肝脏和肠等10个组织,取出后随即放入装有RNAstore的离心管中放于冰上(放于4 °C冰箱保存),待组织全部取完之后放于−80 °C冰箱进行保存备用。采用TRIzol试剂(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA,USA),根据说明书进行总RNA的提取,采用1.5%琼脂糖凝胶电泳法检测其完整性,用微量分光光度计(Nano DROP 2000 COD仪,Thermo Scientific,Wilmington, USA)检测其浓度和质量。以提取的总RNA为模板按照SMARTer RACE cDNA Amplification Kit说明书进行反转,得到5′-RACE和3′-RACE cDNA模板。

    • Silkmaxin基因克隆使用的简并引物与克隆silkmapin基因时所使用的简并引物相同[10],是同时获得的克隆。在获得5′RACE cDNA后进行3′RACE PCR,之后拼接从而得到Silkmaxin的mRNA全长。经电泳检测合格以后进行连接和转化,之后将所得菌液送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。使用Sequencher软件对测序所得到的3′端和5′端序列进行拼接;通过Signal P 3.0软件对信号肽序列进行预测(http://www.cbs.dtu.dk/servies/SignalP.3.0/);通过Phyre2进行(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre/)预测氨基酸序列的二级结构;用SMART软件(http://smart.embl-heidelberg.de/)预测蛋白的结构域;利用ExPAsy(https://www.expasy.org/tools/)预测蛋白分子量、等电点和氨基酸组分。

    • 检测反转后的cDNA产物浓度,之后分别稀释到50 μg/μL。利用NCBI数据库中的primer-blast软件设计silkmaxin基因的荧光定量引物silkmaxin-Q-F和silkmaxin-Q-R(表1)。EF1a为内参基因,其上下游引物分别为EF-a-F和EF-a-R(表1)。按说明书步骤分别依次加入SYBR® Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)(2×)10 μL,silkmaxin-Q-F 0.8 μL,silkmaxin-Q-R 0.8 μL,模板2 μL,最后用ddH2O将总体积补足至20 μL。每个组织的样品设置4个平行。反应程序:95 °C预变性3 min;95 °C变性5 s,60 °C退火20 s,40个循环;温度从60 °C上升至95 °C,之后绘制熔解曲线,从而判断扩增产物的准确性。采用2−△△CT法计算目的基因的相对表达量,运用Origin 8软件绘制柱状图。

      引物名称 primer 序列(5′-3′) sequence (5′-3′) 用途 usage
      EF-a-F GGAACTTCCCAGGCAGACTGTGC qRT-PCR
      EF-a-R TCAAAACGGGCCGCAGAGAAT qRT-PCR
      silkmaxin-Q-F GGTCCCATCACCTCAGTGTC qRT-PCR
      silkmaxin-Q-R TAGCCACCGAAGCCAAAACT qRT-PCR
      silkmaxin-YW-R GATCACTAATACGACTCACTATAGGGTAGCCACCGAAGCCAAAACT ISH
      silkmaxin-F1 TAGACCAACGTACGAAGAATAAGA 3′-RACE
      silkmaxin-R1 ACGCCGTTACTTCAGAATTTC 5′-RACE
      silkmaxin-RNAi-F AAGCAGTCATCATTTTATGTAGCA qRT-PCR
      silkmaxin-RNAi-R TATGCCATCAAGATTGTAAGGA qRT-PCR
      silkmaxin-RNAi-T7+F GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGAAGCAGTCATCATTTTATGTAGCA qRT-PCR
      silkmaxin-RNAi-T7+R GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGTATGCCATCAAGATTGTAAGGA qRT-PCR

      Table 1.  The primers used in the experiment

    • 在设计的荧光定量PCR引物之前添加T7,并将其发送给生工生物工程(上海)进行合成。将新鲜的三角帆蚌外套膜组织取出后迅速得放入到装有4%多聚甲醛的离心管里固定6 h,用0.1 mol/L的磷酸缓冲液(PBS)冲洗固定的组织,转至20%的蔗糖溶液中放入到4 °C冰箱中约20 h后将其取切片(玻片要提前经多聚赖氨酸处理,切片的厚度约为10 mm)。参照DIG nucleic acid detection kit (Roche,瑞士) 说明书进行原位杂交,最后用Detection buffer稀释的NBT/BCIP显色液避光显色3~16 h后在显微镜下观察并拍照。。

    • 在同一批繁育的1龄左右、体长约50 mm、体高约27 mm、体宽约12 mm及体质量约12 g且健康的三角帆蚌中随机挑选出32只,将供片蚌和育珠蚌按1:1的比例进行分配并插片。供片蚌的色线去除后减下3~4 cm2的外套膜边缘膜小片,经消毒后方可插入到育珠蚌后端的外套膜中。在插片后的第3、5、8、11、15、18、22和30天分别从4个育珠蚌中进行珍珠囊取样,将取出的珍珠囊迅速放入装有RNAstore的预冷的离心管中,放于冰上进行低温处理,等组织沉到离心管底端时立即放入−80 °C冰箱保存备用。将每个时间点珍珠囊进行RNA提取并反转录为cDNA再进行荧光定量的检测,荧光定量的引物分别为silkmaxin-Q-F和silkmaxin-Q-R。利用Origin 8.0绘制silkmaxin基因在不同时间点上的珍珠囊荧光定量表达量变化的柱形图。

    • 利用Primer premer 5设计出RNA干扰的引物,在上下游引物前端分别加T7启动子(GCGTAATACGACTCACTATAGGG),扩增silkmaxin基因的PCR产物后割胶回收后将其做为模板,体外转录合成ds RNA。

      具体方法:5×Transcription buffer 25 μL,25 mmol/L NTP mix 10 μL,模板DNA 2.5 μg,RNase inhibitor 120 U,T7 RNA聚合酶80 U,最后用DEPC水将总体积加至为125 μL混匀后放入PCR仪中37 °C处理2 h;反应完成后加10 U DNase I37 °C处理15 min;加270 μL的Rnase free水和450 μL的氯仿混匀后4 °C、12 000 g离心2 min,取上清液加入等体积的异戊醇4 °C 12 000 g离心2 min,去除上清液后再加入1/10的3 mol/L Na Ac和2.5倍的无水乙醇(−20 °C),静置30~60 min,之后4 °C 12 000 g离心8~10 min,弃上清液,用70%的乙醇冲洗沉淀;4 °C 7 500 g离心5 min,干燥后加RNase free水进行溶解;在PCR仪中分别进行70 °C(30 min)和37 °C(30 min)处理;用电泳检测ds RNA的质量,用超微量分光光度计(Nano Drpo 2000 C型OD仪,Thermo Scientific,Wilmington,USA)检测ds RNA的浓度;最后用DEPC水将ds RNA稀释到0.8 μg/L备用。

      每组取6个1龄左右的三角帆蚌,分别用于实验组、对照组和空白组。实验组每一只三角帆蚌注射0.8 μg/L silkmaxin-ds RNA 100 μL,对照组注射相同体积浓度的PBS,空白组不注射。7 d注射1次,总共2次,2周后在外套膜的边缘区和中央区对RNA抑制效果进行荧光定量的检测;将取完组织的贝壳用超纯水冲洗干净后放到干燥凉爽的环境中通风晾干,之后在贝壳珍珠层的边界和棱柱层切1 cm×1 cm的小块,通过SEM扫描电镜进行观察看其壳内表面晶体形态学的差异。

    2.   结果
    • 通过拼接得到了序列全长为1 151 bp的silkmaxin基因的cDNA序列(图1),其中silkmaxin基因的开放阅读框(ORF)大小为885 bp。该序列共编码294个氨基酸,根据信号肽预测的结果发现,N端含有一个由15个氨基酸组成的信号肽。其理论等电点为9.52,分子量为28.39 ku,水源性平均值为0.001,属于亲水性基质蛋白。其氨基酸组成见表2,从表中我们不难看出,此氨基酸序列中甘氨酸(Gly)占整个序列氨基酸总数的33.0%,色氨酸(Ser)的含量占10.4%。

      Figure 1.  Nucleotide and deduced amino acid sequence of silkmaxin

      氨基酸
      amino acid
      数量
      number
      氨基酸所占百分比/%
      percent of total amino acids
      甘氨酸 Gly (G) 92 33.00%
      丝氨酸 Ser (S) 29 10.40%
      酪氨酸 Tyr (Y) 20 7.20%
      脯氨酸 Pro (P) 18 6.50%
      苯丙氨酸 Phe (F) 17 6.10%
      苏氨酸 Thr (T) 16 5.70%
      缬氨酸 Val (V) 16 5.70%
      丙氨酸 Ala (A) 14 5.00%
      异亮氨酸 Ile (I) 12 4.30%
      亮氨酸 Leu (L) 8 2.90%
      精氨酸 Arg (R) 8 2.90%
      天门酰胺 Asn (N) 7 2.50%
      组氨酸 His (H) 6 2.20%
      赖氨酸 Lys (K) 4 1.40%
      色氨酸 Trp (W) 4 1.40%
      天门氨酸 Asp (D) 4 1.40%
      谷氨酰胺 Gln (Q) 3 1.10%
      谷氨酸 Glu (E) 1 0.40%

      Table 2.  Amino acid composition of silkmaxin

    • 使用Phyre2对此基因不包含信号肽的部分进行二级和高级结构的预测(图2),表明了此基质蛋白基因的二级结构中主要是β-折叠结构,其占可预测结构的29%,但却不含有α-螺旋结构,同时可看出,此基质蛋白基因的高级结构类似于细丝状的结构(图2-c)

      Figure 2.  Secondary structure and advanced structure prediction of silkmaxin

    • 半定量结果发现,silkmaxin基因是在外套膜中进行表达的(图3)。再进一步通过荧光定量PCR检测该基因在三角帆蚌的10个组织(边缘膜、缘膜部、中央膜、血液、性腺、肝脏、鳃、闭壳肌、斧足和肠)中的表达情况并进行了分析(图4),结果发现,silkmaxin基因特异表达于三角帆蚌的外套膜的边缘膜上,其他组织虽有涉及,但表达量极低,可忽略。

      Figure 3.  Tissue-specific test of silkmaxin by qRT-PCR

      Figure 4.  Tissue-specific expression of silkmaxin by qRT-PCR

    • 为进一步确定silkmaxin基因在外套膜中的具体表达位置,包括外褶、中褶、内褶,再进一步判断其在贝壳矿化中所起的作用,本实验通过原位杂交,利用地高辛标记的silkmaxin基因特异性探针在外套膜组织上进行原位杂交检测。结果显示,在外套膜组织中其在缘膜部上皮细胞中可以检测到有较强的信号(图5)。

      Figure 5.  In situ hybridization analysis of silkmaxin expression in the mantle of H. cumingii

    • 使用qRT-PCR对基因silkmaxin在第3、5、8、11、15、18、22、30天等8个时间点上对三角帆蚌的珍珠囊进行表达分析检测。其结果显示,silkmaxin基因在第3天到第30天有一个先上升后下降的趋势,第3~5天表达量处于平缓且极低的状态,之后逐步上升到第11天表达量达到最高,而后又开始下降(图6)。

      Figure 6.  The relative expression level of silkmaxin in the pearl sac during the early stages after implantation of pearl formation

    • 利用qRT-PCR检测干扰的有效性。对比干扰前后发现,实验组的表达量相对前两组降低了约40%,而阴性对照组与阳性相对照2组其表达量相差很少,几乎不变(图7)。

      Figure 7.  Expression level of silkmaxin in the mantle by RNAi treatment

      A是珍珠层,珍珠层以一种整洁而均匀的方式排列,它们以层状的方式生长。同一层的霰石几乎是一样的大小。具有成核位点。B是棱柱层,我们观察到的是成熟的棱镜层,表面是平坦的,并且晶体与晶体之间是通过有机基质紧密相连在一起的,中间没有缝隙,板块之间的边界也是清晰可见的。可清楚地看到它的横截面晶体板块是呈现六边形的结构(图8)。

      Figure 8.  SEM images of the surface of the shell of the oysters.

      经过干扰以后的珍珠层,同一层的文石小片的形状不规则,不再是常规的六边形,大小不均匀。成核位点依然是存在的,但却失去了以往的规律性。无序的沉积物在表面出现。总而言之,可以证明,silkmaxin基因在珍珠层形成过程中起着重要的作用。

    3.   讨论
    • 本实验从外套膜cDNA中克隆得到一个新的基质蛋白silkmaxin基因,silkmaxin基因中含有大量的甘基酸和丝氨酸,分别占整个氨基酸序列总数的33%和10.4%(表1),符合贝壳基质蛋白的一般性特征,即大多数的贝壳基质蛋白富含某种或某几种氨基酸[19]Silkmaxin基因在外套膜中有特异性表达,外套膜的原位杂交结果显示表明其表达位置在外套膜的上皮细胞中,推测出silkmaxin基因是一种参与了珍珠层形成的基质蛋白。由于富含甘氨酸和丝氨酸,silkmaxin基因的氨基酸组成具有明显的框架基质蛋白的特性,这类蛋白质一般为非酸性基质蛋白,其主要参与了矿化位点中有机框架的搭建[20]。其二级结构中含有大量的β-折叠结构,并且其高级结构显示出此蛋白为细丝状,是一类类似于丝状蛋白的基质蛋白,所以将其命名为silkmaxin。类丝状蛋白是一组一级结构具有模块化、重复性特点的蛋白质,其中重复性区域包括poly-A或poly-GA的分支、GPGXX/GPGQQ和类似于胶原蛋白的GGX(A=丙氨酸,G=甘氨酸,Q=谷氨酰胺,X=丙氨酸、丝氨酸、缬氨酸、酪氨酸或苏氨酸)[20-24],他们共同组成了一个由穿插在无定形区域的肽段所组成的模块化蛋白质[23, 25-26]

      贝壳有机基质在先前的研究中已经取得了很大的成果,经过分离和鉴定大量基质蛋白以后,分析出了许多基质蛋白的序列结构特点,并且已经获得了大量有关基质蛋白及对碳酸钙结晶影响的资料[5]。但相对于比较复杂的基质蛋白体系来讲,已经被鉴定出的基质蛋白还只是一小部分,而大量的基质蛋白还处于未开发状态。从软体动物外壳的有机基质中发现了一些类似于丝状结构的蛋白质[10, 20, 27-28]。这些蛋白质中包含了大量的甘氨酸或聚丙氨酸的区域,并且在碳酸钙周围的有机基质中也有发现(可能以非晶态凝胶的形式出现)[29-31]。人们还发现了丝蛋白不仅可以诱导和调节CaCO3还对羟基磷灰石的矿化也产生作用[32-35]

      许多参与生物材料生产的蛋白质就像细丝一样,它们的这种相似性主要是由于在一部分蛋白质中含有大量的甘氨酸,而silkmaxin中就含有了大量的甘氨酸,并且二级结构显示它还含有大量的β-折叠结构,高级结构为细丝状,因此,其参与的贝壳矿化机理应该与其他很多类丝状的基质蛋白是相同的。根据珍珠层的矿化分子机理模型显示[30],在珍珠质的矿化过程中,单个文石小片要想形成,首先要搭建矿化的场所,也就是一个有机框架,文石小片是最先形成的几丁质框架,这个过程也有其他框架蛋白的参与,并且这些类丝状蛋白呈无定形水合凝胶状态被大量的填充在几丁质框架的空间之中。类蚕丝蛋白不仅是框架空间的填充物,还是有机框架的介质组成部分,在矿化形成的过程中起了至关重要的作用,它们不仅可以抑制酸性成核位点以外的结晶,同样也是在矿化后被紧紧地封闭于晶体片层之间最终成为了有机框架的一部分[36]。一旦外套膜所分泌出来的基质蛋白进入到外套腔的间液中,那些不可溶性的基质蛋白以及其他生物大分子组成的有机框架结构就会被最先形成,从而这些有机框架连同酸性基质蛋白就会为碳酸钙提供成核位点,而钙离子和碳酸根离子在可溶性基质蛋白的作用下被有序地沉积到有机框架上并完成成核[36-37]。通过对外套膜中silkmaxin基因的RNA干扰表达检测,观察到了壳层内表面的珍珠层文石小片结晶过程发生明显变化,说明此基质蛋白对贝壳珍珠层晶体的大小和形状有调控作用。实验组中的珍珠层的超微结构在晶体层结构以及晶形、晶面和结晶排列等几个方面都出现了很大的变化。珍珠层的变化:①同一层文石小片形状不规则,不再是规则的六边形,有些过大有些过小;②成核位点依然还有,但却失去了原本的规律性;③在表面出现了无序沉积物。

      结合silkmaxin基因在8个时间点的珍珠囊中的表达情况来分析silkmaxin在珍珠早期形成过程中的作用,即无核珍珠生产过程中珍珠囊内沉积物从无到有过程中的作用。3~11 d在珍珠成核的初始阶段,silkmaxin基因的表达量总体是处于逐渐升高的状态,且在11 d时其表达量最高,此时期也属于无序沉积的阶段,并且为珍珠囊继续分泌碳酸钙包裹小颗粒提供了基础。从11 d以后silkmaxin基因的表达量开始下降,且从11~18 d处于珍珠囊内碳酸钙从无序沉积向有序沉积转变的过程,属于珍珠层成核的前期,此时期珍珠囊所分泌的碳酸钙出现了典型的成核现象,silkmaxin参与了此过程的形成。到第25天时珍珠层已经初步形成,并且到了珍珠层的快速生长时期,到第30天以后珍珠层进入了平稳生长时期。在这几个阶段,silkmaxin基因的表达量虽都偏低但仍有表达。经上述讨论和分析显示silkmaxin参与了整个的三角帆蚌珍珠形成阶段,并在珍珠囊中的碳酸钙从无序沉积到有序沉积阶段所做出的转变发挥了重要作用[6]。这也体现了类丝状蛋白的特性,如前所述类丝状蛋白填充进有机框架,形成胶状物,最后在其他蛋白的共同作用下,碳酸钙被填充进去进而取代了胶状物的物质[30]。事实上,类丝状蛋白也参与了有机框架的形成,我们推测silkmaxin正是在矿化的起始过程中发挥了作用,珍珠囊通过大量分泌silkmaxin等有机框架蛋白,改变了碳酸钙的沉积行为。

Reference (37)

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