• ISSN 1000-0615
  • CN 31-1283/S

凡纳滨对虾和罗氏沼虾肠道微生物及抗生素抗性基因多样性分析

洪斌 牛犇 陈萍 李薇 刘海泉 潘迎捷 赵勇

引用本文:
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凡纳滨对虾和罗氏沼虾肠道微生物及抗生素抗性基因多样性分析

    通讯作者: 赵勇, yzhao@shou.edu.cn

Diversity of gut microbiota and antibiotic resistance genes inLitopenaeus vannamei and Macrobrachium rosenbergii

    Corresponding author: Yong ZHAO, yzhao@shou.edu.cn
  • 摘要: 探究凡纳滨对虾和罗氏沼虾肠道微生物及抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes, ARGs)种类的差异。通过高通量测序和变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)技术分析2种虾肠道微生物群落结构差异和微生物多样性,并运用PCR方法检测了2种虾肠道细菌常见38种ARGs的携带情况。结果显示,获得凡纳滨对虾和罗氏沼虾肠道细菌有效序列分别为42 795和40 713条,物种注释单元(operational taxonomic unit, OTU)数目分别为124和82,分类地位明确的细菌种类分别隶属5个门、17个属和5个门、16个属。凡纳滨对虾肠道细菌的优势类群为变形菌门,所占比例为75.45%,优势菌属为副球菌属(25.83%)和不动杆菌属(25.24%);罗氏沼虾肠道细菌的优势类群是厚壁菌门(49.74%),优势菌属为乳球菌属(49.01%)和弧菌属(29.98%)。凡纳滨对虾肠道细菌(2.19)Shannon指数高于罗氏沼虾肠道细菌(1.78),表明前者肠道细菌多样性大于后者。DGGE图谱的分析结果与高通量测序一致,2种虾肠道细菌种类差异很大。PCR结果显示,凡纳滨对虾肠道细菌携带15种ARGs,罗氏沼虾肠道细菌携带14种ARGs。本实验表明凡纳滨对虾肠道细菌的群落种类多样性、OTU丰富度、物种总数和ARGs种类均高于罗氏沼虾肠道细菌,为后续肠道微生物资源的挖掘提供了理论依据。
  • 图 1  稀释性曲线

    Figure 1.  Rarefaction curve of L. vannamei andM. rosenbergii gut bacteria

    图 2  微生物分类学水平的相对丰度统计分析

    Figure 2.  Statistical analysis of relative abundance at the microbial taxonomic levels

    图 3  不同分类水平下的多样本热图与相似性分析

    Figure 3.  Microbial community heatmap analysis and multiple samples similarity tree

    图 4  DGGE图谱

    Figure 4.  DGGE fingerprint

    图 5  凡纳滨对虾肠道细菌部分ARGs的PCR检测结果

    Figure 5.  Detection of gut bacteria ARGs in L. vannamei by PCR

    表 1  38种抗生素抗性基因(ARGS)及其PCR引物

    Table 1.  Thirty-eight antibiotic resistance genes (ARGs) and their PCR primers

    基因
    genes
    引物序列(5′-3′)
    sequence of primers (5′-3′)
    扩增长度/bp
    amplification length
    退火温度/ °C
    annealing temperature
    β-内酰胺类ARGs
    β-lactam ARGs
    CARB FW CAAGTACTTTYAAAACAATAGC 534 46
    RV GCTGTAATACTCCKAGCAC
    SHV FW GCGAAAGCCAGCTGTCGGGC 304 62
    RV GATTGGCGGCGCTGTTATCGC
    SHV-5 FW TGTTAGCCACCCTGCCGCT 825 61
    RV GTTGCCAGTGCTCGATCAG
    ampC FW GTGACCAGATACTGGCCACA 822 61
    RV TTACTGTAGCGCCTCGAGGA
    mecA FW TAATAGTTGTAGTTGTCGGGTTTG 733 61
    RV TAACCTAATAGATGTGAAGTCGCT
    四环素类ARGs
    tetracycline ARGs
    tetA FW GCGCTNTATGCGTTGATGCA 387 62
    RV ACAGCCCGTCAGGAAATT
    tetB FW TACGTGAATTTATTGCTTCGG 206 60
    RV ATACAGCATCCAAAGCGCAC
    tetM FW ACAGAAAGCTTATTATATAAC 171 60
    RV TGGCGTGTCTATGATGTTCAC
    tetO FW ACGGARAGTTTATTGTATACC 171 60
    RV TGGCGTATCTATAATGTTGAC
    tetQ FW AGAATCTGCTGTTTGCCAGTG 169 63
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    ·续表1·
    基因
    genes
    引物序列(5′-3′)
    sequence of primers (5′-3′)
    扩增长度/bp
    amplification length
    退火温度/ °C
    annealing temperature
    RV CGGAGTGTCAATGATATTGCA
    tetS FW GAAAGCTTACTATACAGTAGC 169 50
    RV AGGAGTATCTACAATATTTAC
    tetW FW GAGAGCCTGCTATATGCCAGC 168 64
    RV GGGCGTATCCACAATGTTAAC
    tetK FW TCGATAGGAACAGCAGTA 169 61
    RV CAGCAGATCCTACTCCTT
    氨基糖苷类ARGs
    aminoglycoside ARGs
    aph(2′′)-Ib FW CTTGGACGCTGAGATATATGAGCAC 867 55
    RV GTTTGTAGCAATTCAGAAACACCCTT
    strA FW CTTGGTGATAACGGCAATTC 548 55
    RV CCAATCGCAGATAGAAGGC
    strB FW ATCGTCAAGGGATTGAAACC 509 56
    RV GGATCGTAGAACATATTGGC
    aadA FW ATCCTTCGGCGCGATTTTG 283 56
    RV GCAGCGCAATGACATTCTTG
    aadE FW ATGGAATTATTCCCACCTGA 386 50
    RV TCAAAACCCCTATTAAAGCC
    aac(6ˊ)-Ib FW TATGAGTGGCTAAATCGAT 395 55
    RV CCCGCTTTCTCGTAGCA
    armA FW CCGAAATGACAGTTCCTATC 846 56
    RV GAAAATGAGTGCCTTGGAGG
    rmtB FW ATGAACATCAACGATGCCCT 769 56
    RV CCTTCTGATTGGCTTATCCA
    喹诺酮类ARGs
    quinolone ARGs
    qnrS FW CCCCATGCCCGAAGTTATCA 457 59
    RV ACTGCTTGGAGTGTGTTGGT
    aac(6ˊ)-Ib-cr FW ATATGCGGATCCAATGAGCAACGCAAAAACAAAGTTAG 544 66
    RV ATAGCGAATTCTTAGGCATCACTGCGTGTTCGCTC
    qnrA FW ATTTCTCACGCCAGGATTTG 413 56
    RV GAGATTGGCATTGCTCCAGT
    gryA FW CGATGTCGGTCATTGTTGGC 455 61
    RV ATACCTACGGCGATACCGGA
    qnrC FW TTCGATCGGACTGCTTGTGG 438 59
    RV AACACATGGTGCAGGGGATT
    qnrD FW GCTGGAGCTTGTCAGGGATT 585 59
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    ·续表1·
    基因
    genes
    引物序列(5′-3′)
    sequence of primers (5′-3′)
    扩增长度/bp
    amplification length
    退火温度/ °C
    annealing temperature
    RV TGCTGCGAGATATCATGCGT
    parC FW GCCTAAACAACGCACGGAAA 432 59
    RV TGACACGGGAGGTAACCAGA
    qnrB FW TGGTGCTGTATGCACCGAAT 453 58
    RV TCATCGCGCTGAAGAACTGT
    氯霉素类ARGs
    chloramphenicol ARGs
    catI FW GGTGATATGGGATAGTGTT 349 60
    RV CCATCACATACTGCATGATG
    catII FW GATTGACCTGAATACCTGGAA 567 60
    RV CCATCACATACTGCATGATG
    catIII FW CCATACTCATCCGATATTGA 275 60
    RV CCATCACATACTGCATGATG
    catIV FW CCGGTAAAGCGAAATTGTAT 451 60
    RV CCATCACATACTGCATGATG
    floR FW CGCCGTCATTCCTCACCTTC 215 50
    RV GATCACGGGCCACGCTGTGTC
    磺胺类ARGs
    sulfonamide ARGs
    sulI FW CGCACCGGAAACATCGCTGCAC 163 63
    RV TGAAGTTCCGCCGCAAGGCTCG
    sulII FW TCCGGTGGAGGCCGGTATCTGG 191 63
    RV CGGGAATGCCATCTGCCTTGAG
    sulIII FW TCCGTTCAGCGAATTGGTGCAG 128 61
    RV TTCGTTCACGCCTTACACCAGC
    sulA FW TCTTGAGCAAGCACTCCAGCAG 299 61
    RV TCCAGCCTTAGCAACCACATGG
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    表 2  凡纳滨对虾和罗氏沼虾肠道微生物多样性统计分析

    Table 2.  Statistical analysis of microbial diversity in L. vannamei and M. rosenbergii

    样本
    samples
    有效读数
    effective reads
    OTU Ace指数
    Ace index
    Chao指数
    Chao index
    Shannon指数
    Shannon index
    Simpson指数
    Simpson index
    凡纳滨对虾肠道细菌
    P. vannamei gut bacteria
    40 713 124 124 124 2.79 0.103 9
    罗氏沼虾肠道细菌
    M. rosenbergii gut bacteria
    40 713 82 90 95 1.78 0.296 7
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    表 3  凡纳滨对虾和罗氏沼虾肠道细菌抗性基因ARGs检出情况

    Table 3.  Detection occurrence of ARGs in L. vannamei and M. rosenbergii gut bacteria

    抗性基因
    ARGs
    凡纳滨对虾肠道细菌
    P. vannamei gut bacteria
    罗氏沼虾肠道细菌
    M. rosenbergii gut bacteria
    β-内酰胺类ARGs (β-lactam ARGs)
    CARB 0/10 (0) 0/10 (0)
    SHV 4/10 (40%) 10/10 (100%)
    SHV-5 0/10 (0) 2/10 (20%)
    ampC 3/10 (30%) 0/10 (0)
    mecA 0/10 (0) 0/10 (0)
    四环素类ARGs (tetracycline ARGs)
    tetA 10/10 (100%) 10/10 (100%)
    tetB 8/10 (80%) 0/10 (0)
    tetM 4/10 (40%) 2/10 (20%)
    tetO 0/10 (0) 5/10 (50%)
    tetQ 0/10 (0) 0/10 (0)
    tetS 10/10 (100%) 10/10 (100%)
    tetW 0/10 (0) 0/10 (0)
    tetK 0/10 (0) 0/10 (0)
    氨基糖苷类ARGs (aminoglycoside ARGs)
    aph (2′′)-Ib 0/10 (0) 0/10 (0)
    strA 10/10 (100%) 0/10 (0)
    strB 10/10 (100%) 0/10 (0)
    aadA 3/10 (30%) 10/10 (100%)
    aadE 3/10 (30%) 8/10 (80%)
    aac (6ˊ)-Ib 2/10 (20%) 0/10 (0)
    armA 0/10 (0) 0/10 (0)
    rmtB 0/10 (0) 0/10 (0)
    喹诺酮类ARGs (quinolone ARGs)
    qnrS 0/10 (0) 10/10 (100%)
    aac(6ˊ)-Ib-cr 0/10 (0) 0/10 (0)
    qnrA 0/10 (0) 0/10 (0)
    gryA 10/10 (100%) 10/10 (100%)
    qnrC 0/10 (0) 0/10 (0)
    qnrD 0/10 (0) 0/10 (0)
    parC 0/10 (0) 0/10 (0)
    qnrB 0/10 (0) 0/10 (0)
    氯霉素类ARGs (chloramphenicol ARGs)
    catI 0/10 (0) 0/10 (0)
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    ·续表3·
    抗性基因
    ARGs
    凡纳滨对虾肠道细菌
    P. vannamei gut bacteria
    罗氏沼虾肠道细菌
    M. rosenbergii gut bacteria
    catII 2/10 (20%) 0/10 (0)
    catIII 0/10 (0) 0/10 (0)
    catIV 0/10 (0) 0/10 (0)
    floR 10/10 (100%) 3/10 (30%)
    磺胺类ARGs (sulfonamide ARGs)
    sulI 0/10 (0) 10/10 (100%)
    sulII 10/10 (100%) 10/10 (100%)
    sulIII 0/10 (0) 4/10 (40%)
    sulA 0/10 (0) 0/10 (0)
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    [17] 马欢褚吉兴王丽燕李富花相建海 . 凡纳滨对虾卵巢类围食膜蛋白基因克隆及其在早期胚胎发育中的表达. 水产学报, 2017, 41(5): 649-657. doi: 10.11964/jfc.20160710479
    [18] 罗衡赵良杰李丰郭海松沈竑刘其根 . 养殖鳖的引入对稻田土壤细菌群落结构的影响. 水产学报, 2018, 42(5): 720-732. doi: 10.11964/jfc.20170310730
    [19] 段秀霞施文正汪之和王锡昌江敏 . 熟制与贮藏对凡纳滨对虾挥发性成分的影响. 水产学报, 2017, 41(6): 971-983. doi: 10.11964/jfc.20170310751
    [20] 刘青云李强勇王韶韶朱威霖彭敏曾地刚陈秀荔杨春玲赵永贞彭金霞何苹萍韦嫔媛陈晓汉 . 凡纳滨对虾LvRab5B蛋白与IHHNV病毒蛋白的互作. 水产学报, 2018, 42(11): 1829-1839. doi: 10.11964/jfc.20170810929
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出版历程
  • 收稿日期:  2018-08-13
  • 录用日期:  2018-09-18
  • 网络出版日期:  2019-04-12
  • 刊出日期:  2019-05-01

凡纳滨对虾和罗氏沼虾肠道微生物及抗生素抗性基因多样性分析

    通讯作者: 赵勇, yzhao@shou.edu.cn
  • 1. 上海海洋大学食品学院,上海    201306
  • 2. 上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心,上海    201306
  • 3. 农业农村部水产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室(上海),上海    201306
  • 4. 上海海洋大学食品热加工工程技术研究中心,上海    201306

摘要: 探究凡纳滨对虾和罗氏沼虾肠道微生物及抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes, ARGs)种类的差异。通过高通量测序和变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)技术分析2种虾肠道微生物群落结构差异和微生物多样性,并运用PCR方法检测了2种虾肠道细菌常见38种ARGs的携带情况。结果显示,获得凡纳滨对虾和罗氏沼虾肠道细菌有效序列分别为42 795和40 713条,物种注释单元(operational taxonomic unit, OTU)数目分别为124和82,分类地位明确的细菌种类分别隶属5个门、17个属和5个门、16个属。凡纳滨对虾肠道细菌的优势类群为变形菌门,所占比例为75.45%,优势菌属为副球菌属(25.83%)和不动杆菌属(25.24%);罗氏沼虾肠道细菌的优势类群是厚壁菌门(49.74%),优势菌属为乳球菌属(49.01%)和弧菌属(29.98%)。凡纳滨对虾肠道细菌(2.19)Shannon指数高于罗氏沼虾肠道细菌(1.78),表明前者肠道细菌多样性大于后者。DGGE图谱的分析结果与高通量测序一致,2种虾肠道细菌种类差异很大。PCR结果显示,凡纳滨对虾肠道细菌携带15种ARGs,罗氏沼虾肠道细菌携带14种ARGs。本实验表明凡纳滨对虾肠道细菌的群落种类多样性、OTU丰富度、物种总数和ARGs种类均高于罗氏沼虾肠道细菌,为后续肠道微生物资源的挖掘提供了理论依据。

English Abstract

  • 凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei),又名南美白对虾、白对虾,隶属于对虾科(Penaeidae)、对虾属(Penaeus),因其味道鲜美、营养丰富,深受广大消费者的青睐,是集约化高产养殖的优良品种[1]。近年来,因其具有生长快、抗病力强、耐高密度养殖等特点,逐渐成为我国重要养殖虾种。罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)又名淡水长臂大虾、马来西亚大虾,隶属长臂虾科(Palaemonidae)、沼虾属(Macrobrachium),原产于东南亚和印度,是重要的淡水经济虾类[2]。20世纪70年代,中国水产科学研究院珠江水产研究所从马来西亚、日本引进罗氏沼虾,并向全国多个省市推广养殖。现在中国罗氏沼虾年产值达300亿元,产量为13.5×104 t[3]

    肠道微生物被视为一个特殊的“器官”,对宿主健康至关重要[4]。据报道,稳定的肠道微生物区系影响着宿主多种功能,如肠道微生物的建立和感染敏感性。肠道微生物被认为对宿主免疫、营养代谢及适应性等功能有重要影响。研究肠道微生物组成对了解虾肠道微生物生理生化功能、重要经济虾类的养殖繁育及病害防治有重要意义[5-6],可更好地理解肠道微生物与宿主之间的关系。目前,对水产养殖动物肠道微生物多样性进行的研究很多,如草鱼(Ctenopharyngodon idella)[7]、黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)[5]、斑节对虾(P. monodon)[8]和太平洋蓝虾(Litopenaeus stylirostris)[9]等,但对于凡纳滨对虾和罗氏沼虾知之甚少。

    高通量测序技术具有高准确度和高通量等优势,随着成本的降低,已成为当前研究环境群落结构差异及微生物多样性的重要技术手段[10-11]。变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)技术于1999年首次被应用在食品微生物学中,Ampe等[12]公布了一份关于发酵玉米面团中微生物空间分布的评估工作,通过直接从样品中提取DNA并扩增16S rDNAV3可变区后得到的DGGE图谱,对纯化的DNA片段进行测序从而鉴定乳酸菌。随后全世界科学家将其广泛应用于食品中微生物群落结构的评估[13]

    近年来,水产养殖中抗生素的频繁使用和不规范使用导致水环境中抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes, ARGs)和耐药致病菌(如超级细菌)的产生[14]。ARGs作为新兴环境污染物[15-16],不仅存在于土壤和水环境中,还存在于动物体内,甚至空气和人类饮用水中[17-19]。携带ARGs的移动遗传元件可以通过水平基因转移(horizontal gene transfer, HGT)流动到土著细菌或其他环境中,甚至可以转移到人类共生细菌和病原菌中,对人类健康存在潜在的危害[20]

    本研究通过比较凡纳滨对虾和罗氏沼虾肠道微生物及其抗生素抗性基因种类的差异,利用高通量测序和DGGE技术分析2种虾肠道微生物群落结构差异和微生物多样性,并检测2种虾肠道细菌常见38种ARGs的携带情况。

    • 实验用凡纳滨对虾(海水养殖)和罗氏沼虾(淡水养殖)均于2017年9月下旬采自上海江阳水产品市场(上海市宝山区泰和路1700号);所采样品经过冲氧处理后及时运回实验室。在无菌条件下剖取虾肠道置于灭菌离心管中,保存于–80 °C超低温冰箱以备DNA提取。

    • 从–80 °C超低温冰箱离心管取凡纳滨对虾和罗氏沼虾肠道样品各5条于1.5 mL离心管,在无菌条件下用电动组织研磨器[OSE-Y10,天根生化科技(北京)有限公司]充分研磨,参照粪便基因组DNA提取试剂盒[DP328-02,天根生化科技(北京)有限公司]说明书步骤提取总DNA。2%琼脂糖凝胶电泳分析样本DNA的完整性,以及Bio Tek多功能酶标仪(Synergy2,美国伯腾仪器有限公司)测定其浓度,达实验要求的总DNA保存于–80 °C。

    • 上述DNA样品送至上海美吉生物医药科技有限公司进行高通量测序,测序平台为MiSeq PE300,采用引物338F (5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)对细菌16S rDNA基因V3~V4区进行PCR扩增。PCR反应体系:5×FastPfu buffer 4 μL,2.5 mmol/L dNTPs 2 μL,TransStart FastPfu DNA Polymerase 0.4 μL,正、反向引物(5 μmol/L)各0.8 μL,合格DNA模板2 μL,ddH2O补充至总体积20 μL。PCR反应条件:95 °C预变性3 min;95 °C变性30 s,55 °C退火30 s,72 °C延伸45 s,30个循环;72 °C终延伸 10 min。2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物条带是否存在,最后将PCR产物用QuantiFluor™ -ST蓝色荧光定量系统(Promega公司)进行定量。

    • 用Usearch (version 7.1)软件对数据进行处理,97%相似度水平筛选可操作分类单元(OTU)。根据样品OTU与Silva数据库[21]的相似性比对结果进行物种注释和分析优势物种的OTU picking,所得结果用GraphPad Prism 5软件绘制群落结构组分图。根据分类学统计结果分析凡纳滨对虾和罗氏沼虾肠道微生物的群落结构和组成比例,绘制Rank-Abundance曲线,以此反映虾肠道所含物种的均匀度和丰富度。最后用Mothur软件对Shannon指数、Chao1、ACE和Simpson指数等进行计算分析。

    • 基于凡纳滨对虾和罗氏沼虾肠道细菌代表性序列数计算并绘制热图(heat map)[22],以反映2种虾肠道微生物在门和属水平上群落组成的相似性和差异性。用R语言Vegan包进行Hclust聚类分析和Vegdist距离计算,聚类方法为Complete,距离算法用Bray-Curtis法。

    • 以上述提取的基因组DNA为模板,PCR扩增其16S rDNA的V3区,引物为细菌的16S rDNA的V3 可变区通用引物[23]。PCR反应条件:94 °C预变性3 min;94 °C变性1 min,55 °C退火1 min,72 °C延伸1 min,30个循环;72 °C终延伸5 min,4 °C保存备用。PCR产物用BIO-RAD Dcode系统进行DGGE分析,其中变性梯度为40%~60%,聚丙烯酰胺胶浓度为8%,在1×TAE电泳缓冲液中电泳10 h(100 V、60 °C)。凝胶用SYBR Green I染色2次(各10 min),最后对凝胶图像进行分析。

    • 本研究选取了6类共38种常见的ARGs:5种β-内酰胺类ARGs、8种四环素类ARGs、8种氨基糖苷类ARGs、8种喹诺酮类ARGs、5种氯霉素类ARGs和4种磺胺类ARGs作为目的基因,采用PCR技术对目的基因进行扩增。引物序列、退火温度及反应体系等参考已有文献(1)[24-25]。得到的PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测,并送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序,经过NCBI数据库BLAST比对确认其是目的片段。

      基因
      genes
      引物序列(5′-3′)
      sequence of primers (5′-3′)
      扩增长度/bp
      amplification length
      退火温度/ °C
      annealing temperature
      β-内酰胺类ARGs
      β-lactam ARGs
      CARB FW CAAGTACTTTYAAAACAATAGC 534 46
      RV GCTGTAATACTCCKAGCAC
      SHV FW GCGAAAGCCAGCTGTCGGGC 304 62
      RV GATTGGCGGCGCTGTTATCGC
      SHV-5 FW TGTTAGCCACCCTGCCGCT 825 61
      RV GTTGCCAGTGCTCGATCAG
      ampC FW GTGACCAGATACTGGCCACA 822 61
      RV TTACTGTAGCGCCTCGAGGA
      mecA FW TAATAGTTGTAGTTGTCGGGTTTG 733 61
      RV TAACCTAATAGATGTGAAGTCGCT
      四环素类ARGs
      tetracycline ARGs
      tetA FW GCGCTNTATGCGTTGATGCA 387 62
      RV ACAGCCCGTCAGGAAATT
      tetB FW TACGTGAATTTATTGCTTCGG 206 60
      RV ATACAGCATCCAAAGCGCAC
      tetM FW ACAGAAAGCTTATTATATAAC 171 60
      RV TGGCGTGTCTATGATGTTCAC
      tetO FW ACGGARAGTTTATTGTATACC 171 60
      RV TGGCGTATCTATAATGTTGAC
      tetQ FW AGAATCTGCTGTTTGCCAGTG 169 63

      表 1  38种抗生素抗性基因(ARGS)及其PCR引物

      Table 1.  Thirty-eight antibiotic resistance genes (ARGs) and their PCR primers

      ·续表1·
      基因
      genes
      引物序列(5′-3′)
      sequence of primers (5′-3′)
      扩增长度/bp
      amplification length
      退火温度/ °C
      annealing temperature
      RV CGGAGTGTCAATGATATTGCA
      tetS FW GAAAGCTTACTATACAGTAGC 169 50
      RV AGGAGTATCTACAATATTTAC
      tetW FW GAGAGCCTGCTATATGCCAGC 168 64
      RV GGGCGTATCCACAATGTTAAC
      tetK FW TCGATAGGAACAGCAGTA 169 61
      RV CAGCAGATCCTACTCCTT
      氨基糖苷类ARGs
      aminoglycoside ARGs
      aph(2′′)-Ib FW CTTGGACGCTGAGATATATGAGCAC 867 55
      RV GTTTGTAGCAATTCAGAAACACCCTT
      strA FW CTTGGTGATAACGGCAATTC 548 55
      RV CCAATCGCAGATAGAAGGC
      strB FW ATCGTCAAGGGATTGAAACC 509 56
      RV GGATCGTAGAACATATTGGC
      aadA FW ATCCTTCGGCGCGATTTTG 283 56
      RV GCAGCGCAATGACATTCTTG
      aadE FW ATGGAATTATTCCCACCTGA 386 50
      RV TCAAAACCCCTATTAAAGCC
      aac(6ˊ)-Ib FW TATGAGTGGCTAAATCGAT 395 55
      RV CCCGCTTTCTCGTAGCA
      armA FW CCGAAATGACAGTTCCTATC 846 56
      RV GAAAATGAGTGCCTTGGAGG
      rmtB FW ATGAACATCAACGATGCCCT 769 56
      RV CCTTCTGATTGGCTTATCCA
      喹诺酮类ARGs
      quinolone ARGs
      qnrS FW CCCCATGCCCGAAGTTATCA 457 59
      RV ACTGCTTGGAGTGTGTTGGT
      aac(6ˊ)-Ib-cr FW ATATGCGGATCCAATGAGCAACGCAAAAACAAAGTTAG 544 66
      RV ATAGCGAATTCTTAGGCATCACTGCGTGTTCGCTC
      qnrA FW ATTTCTCACGCCAGGATTTG 413 56
      RV GAGATTGGCATTGCTCCAGT
      gryA FW CGATGTCGGTCATTGTTGGC 455 61
      RV ATACCTACGGCGATACCGGA
      qnrC FW TTCGATCGGACTGCTTGTGG 438 59
      RV AACACATGGTGCAGGGGATT
      qnrD FW GCTGGAGCTTGTCAGGGATT 585 59
      ·续表1·
      基因
      genes
      引物序列(5′-3′)
      sequence of primers (5′-3′)
      扩增长度/bp
      amplification length
      退火温度/ °C
      annealing temperature
      RV TGCTGCGAGATATCATGCGT
      parC FW GCCTAAACAACGCACGGAAA 432 59
      RV TGACACGGGAGGTAACCAGA
      qnrB FW TGGTGCTGTATGCACCGAAT 453 58
      RV TCATCGCGCTGAAGAACTGT
      氯霉素类ARGs
      chloramphenicol ARGs
      catI FW GGTGATATGGGATAGTGTT 349 60
      RV CCATCACATACTGCATGATG
      catII FW GATTGACCTGAATACCTGGAA 567 60
      RV CCATCACATACTGCATGATG
      catIII FW CCATACTCATCCGATATTGA 275 60
      RV CCATCACATACTGCATGATG
      catIV FW CCGGTAAAGCGAAATTGTAT 451 60
      RV CCATCACATACTGCATGATG
      floR FW CGCCGTCATTCCTCACCTTC 215 50
      RV GATCACGGGCCACGCTGTGTC
      磺胺类ARGs
      sulfonamide ARGs
      sulI FW CGCACCGGAAACATCGCTGCAC 163 63
      RV TGAAGTTCCGCCGCAAGGCTCG
      sulII FW TCCGGTGGAGGCCGGTATCTGG 191 63
      RV CGGGAATGCCATCTGCCTTGAG
      sulIII FW TCCGTTCAGCGAATTGGTGCAG 128 61
      RV TTCGTTCACGCCTTACACCAGC
      sulA FW TCTTGAGCAAGCACTCCAGCAG 299 61
      RV TCCAGCCTTAGCAACCACATGG
    • 通过MiSeq测序平台对凡纳滨对虾和罗氏沼虾肠道细菌的16S rDNA基因V3~V4区进行微生物多样性检测,分别获得细菌总优化序列42 795和40 713条,碱基平均长度为442 bp。采用Mothur软件制作稀释性曲线(rarefaction curve)。随着测序的进行和序列数目的增加,曲线逐渐平稳,表明测序数据量合理可靠(图1)。

      图  1  稀释性曲线

      Figure 1.  Rarefaction curve of L. vannamei andM. rosenbergii gut bacteria

    • 在Silva数据库进行优化序列相似性比对,采用RDP classifier贝叶斯算法进行OTU序列分类(97%相似水平),凡纳滨对虾肠道细菌获得OTU 124个,罗氏沼虾肠道细菌获得OTU 82个,共同含有OTU 67个。根据分类学注释结果,分别在门和属水平进行样品物种丰度的统计分析,结果显示,凡纳滨对虾肠道细菌门水平多集中于变形菌门(Proteobacteria) (75.45%)、软壁菌门(Tenericutes) (17.47%),而厚壁菌门(Firmicutes) (0.76%)、拟杆菌门(Bacteroidetes) (0.28%)、放线菌门(Actinobacteria) (5.52%),其他及未分类细菌所占比例0.51%(图2-a),通过种属分类水平上的统计分析,确定的优势菌属为副球菌属(Paracoccus) (25.83%)和不动杆菌属(Acinetobacter) (25.24%);罗氏沼虾肠道细菌门水平主要为变形菌门 (41.46%)、厚壁菌门 (49.74%)、拟杆菌门 (4.21%)、软壁菌门 (2.34%)和放线菌门 (2.12%),其他及未分类细菌所占比例为0.14%(图2-b),优势菌属为乳球菌属(Lactococcus) (49.01%)和弧菌属(Vibrio) (29.98%)。

      图  2  微生物分类学水平的相对丰度统计分析

      Figure 2.  Statistical analysis of relative abundance at the microbial taxonomic levels

    • 将获得的凡纳滨对虾和罗氏沼虾肠道细菌有效序列进行抽平分析,各抽40 713条序列进行比对,获得分类学地位明确的细菌种类分别隶属5个门、17个属和5个门、16个属,采用Mothur软件进行多样性指数统计分析(Shannon指数、Chao指数、ACE指数和Simpson指数),测序结果覆盖率均在99.97%以上,表明数据有效可靠。凡纳滨对虾肠道细菌(2.19) Shannon指数高于罗氏沼虾肠道细菌(1.78),表明前者肠道细菌多样性大于后者。从整体来看,凡纳滨对虾肠道细菌OTU丰富度、物种总数与群落多样性指数高于罗氏沼虾肠道细菌(表2)。根据Usearch软件分析每个有效序列OTU所占的丰度比例绘制heat map,聚类结果显示,凡纳滨对虾肠道细菌种类和数量均多于罗氏沼虾肠道细菌,2个样品肠道微生物相似度不高(图3)。

      样本
      samples
      有效读数
      effective reads
      OTU Ace指数
      Ace index
      Chao指数
      Chao index
      Shannon指数
      Shannon index
      Simpson指数
      Simpson index
      凡纳滨对虾肠道细菌
      P. vannamei gut bacteria
      40 713 124 124 124 2.79 0.103 9
      罗氏沼虾肠道细菌
      M. rosenbergii gut bacteria
      40 713 82 90 95 1.78 0.296 7

      表 2  凡纳滨对虾和罗氏沼虾肠道微生物多样性统计分析

      Table 2.  Statistical analysis of microbial diversity in L. vannamei and M. rosenbergii

      图  3  不同分类水平下的多样本热图与相似性分析

      Figure 3.  Microbial community heatmap analysis and multiple samples similarity tree

    • 本实验采用PCR-DGGE技术扩增16S rDNA的V3区目的片段,以探讨不同虾肠道中细菌的分布是否具有相似性。结果显示,凡纳滨对虾和罗氏沼虾肠道细菌DGGE图谱差异较大,二者条带的数量、所示位置及亮度均具有差异,表明不同虾肠道中的细菌种类、优势菌种均不同。DGGE图谱分析结果与高通量测序所得结果一致,2种虾肠道细菌种类差异较大(图4)。

      图  4  DGGE图谱

      Figure 4.  DGGE fingerprint

    • 本实验共检测了6大类ARGs,凡纳滨对虾肠道细菌携带15种ARGs,罗氏沼虾肠道细菌携带14种ARGs,6大类均有检出(3图5)。凡纳滨对虾肠道细菌检测出SHV、ampCtetAtetBtetMtetSstrAstrBaadAaadEaac ()-IbgryAcatII、floRsulII,而罗氏沼虾肠道细菌检测了SHV、SHV-5、tetAtetMtetOtetSaadAaadEqnrSgryAfloRsulI、sulII和sulIII,体现了抗性基因存在的多样性。其中SHV、tetAtetMtetSaadAaadEgyrAfloRsulII是二者均存在的抗性基因。

      抗性基因
      ARGs
      凡纳滨对虾肠道细菌
      P. vannamei gut bacteria
      罗氏沼虾肠道细菌
      M. rosenbergii gut bacteria
      β-内酰胺类ARGs (β-lactam ARGs)
      CARB 0/10 (0) 0/10 (0)
      SHV 4/10 (40%) 10/10 (100%)
      SHV-5 0/10 (0) 2/10 (20%)
      ampC 3/10 (30%) 0/10 (0)
      mecA 0/10 (0) 0/10 (0)
      四环素类ARGs (tetracycline ARGs)
      tetA 10/10 (100%) 10/10 (100%)
      tetB 8/10 (80%) 0/10 (0)
      tetM 4/10 (40%) 2/10 (20%)
      tetO 0/10 (0) 5/10 (50%)
      tetQ 0/10 (0) 0/10 (0)
      tetS 10/10 (100%) 10/10 (100%)
      tetW 0/10 (0) 0/10 (0)
      tetK 0/10 (0) 0/10 (0)
      氨基糖苷类ARGs (aminoglycoside ARGs)
      aph (2′′)-Ib 0/10 (0) 0/10 (0)
      strA 10/10 (100%) 0/10 (0)
      strB 10/10 (100%) 0/10 (0)
      aadA 3/10 (30%) 10/10 (100%)
      aadE 3/10 (30%) 8/10 (80%)
      aac (6ˊ)-Ib 2/10 (20%) 0/10 (0)
      armA 0/10 (0) 0/10 (0)
      rmtB 0/10 (0) 0/10 (0)
      喹诺酮类ARGs (quinolone ARGs)
      qnrS 0/10 (0) 10/10 (100%)
      aac(6ˊ)-Ib-cr 0/10 (0) 0/10 (0)
      qnrA 0/10 (0) 0/10 (0)
      gryA 10/10 (100%) 10/10 (100%)
      qnrC 0/10 (0) 0/10 (0)
      qnrD 0/10 (0) 0/10 (0)
      parC 0/10 (0) 0/10 (0)
      qnrB 0/10 (0) 0/10 (0)
      氯霉素类ARGs (chloramphenicol ARGs)
      catI 0/10 (0) 0/10 (0)

      表 3  凡纳滨对虾和罗氏沼虾肠道细菌抗性基因ARGs检出情况

      Table 3.  Detection occurrence of ARGs in L. vannamei and M. rosenbergii gut bacteria

      ·续表3·
      抗性基因
      ARGs
      凡纳滨对虾肠道细菌
      P. vannamei gut bacteria
      罗氏沼虾肠道细菌
      M. rosenbergii gut bacteria
      catII 2/10 (20%) 0/10 (0)
      catIII 0/10 (0) 0/10 (0)
      catIV 0/10 (0) 0/10 (0)
      floR 10/10 (100%) 3/10 (30%)
      磺胺类ARGs (sulfonamide ARGs)
      sulI 0/10 (0) 10/10 (100%)
      sulII 10/10 (100%) 10/10 (100%)
      sulIII 0/10 (0) 4/10 (40%)
      sulA 0/10 (0) 0/10 (0)

      图  5  凡纳滨对虾肠道细菌部分ARGs的PCR检测结果

      Figure 5.  Detection of gut bacteria ARGs in L. vannamei by PCR

    • 肠道微生物是肠道的重要组成部分,在维持进化、机体代谢及发育等方面发挥重要作用[26]。本实验通过高通量和DGGE技术对2种不同虾肠道微生物多样性和菌落结构进行了研究,结果发现,凡纳滨对虾和罗氏沼虾肠道微生物种类差异显著,且凡纳滨对虾肠道细菌的群落种类多样性、OTU丰富度和物种总数均高于罗氏沼虾肠道细菌。凡纳滨对虾肠道细菌的优势类群是变形菌门,所占比例为75.45%,其也常见于其他虾肠道中,比如墨吉对虾(P. merguiensis)[27]、斑节对虾[8]和太平洋蓝虾[9];而罗氏沼虾肠道细菌的优势类群是厚壁菌门(49.74%),其也常见上述虾肠道中。变形菌门和厚壁菌门可能是水产养殖动物中的优势菌群。凡纳滨对虾肠道细菌优势菌属为副球菌属(25.83%)和不动杆菌属(25.24%),而罗氏沼虾肠道细菌优势菌属为乳球菌属(49.01%)和弧菌属(29.98%)。这与之前报道的草鱼肠道中的优势菌属为鲸杆菌属(Cetobacterium)和拟杆菌属(Bacteroides),丰度超过50%[28]的结论有所不同。有研究表明,当鱼类在高密度养殖时,肠道中鲸杆菌属的相对丰度将增加7~11倍[29]。凡纳滨对虾肠道中的鲸蜡菌属丰度可能与低放养密度有关。不同水产养殖动物,其肠道优势菌属不同,可能与宿主摄食、生长环境、饲养密度和水质有关,反映了宿主抗病性和生长速度的异质性。利用肠道宏基因组测序技术开展肠道微生物与宿主免疫和宿主食性2个方面是未来研究可推进的方向。

      水产养殖中抗生素的频繁使用导致水环境中ARGs出现,这可能对水生动物的敏感细菌产生选择性压力[30-31]。本实验发现,凡纳滨对虾肠道环境中存在15种ARGs,罗氏沼虾肠道中存在14种ARGs,说明ARGs已经广泛存在于水产养殖动物肠道中。细菌可通过接合、噬菌体转导和自然转化的水平基因转移途径将遗传信息传递给彼此[32]。最近的研究表明,基因转移在肠道中很常见,抗生素抗性基因水平转移是基因组中可移动遗传因子从一株菌株转移到另一株菌株中,从而使后者获得该抗生素抗性的过程。因此,通过食物链关系,虾等水产养殖动物肠道食源性致病菌中携带的ARGs转移到人类肠道微生物中,将对人类健康产生潜在的危害和将增加治疗细菌感染的难度。

参考文献 (32)

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